摘要：生物超弱發光是生物系統在生命活動中的微弱發光現象。為了準確測量生物超弱發光，設計了一種用于生物超微弱發光的專用采集系統。系統的激發光源由單只大功率LED及光學系統構成，用壓控恒流源調整LED光照強度，通過電子快門精確控制光探測器的采集時間。測量金心吊蘭葉片的延遲發光結果表明，該系統測量精度高、重復性好。
關鍵詞：生物超弱發光；檢測；電子快門；壓控恒流源
O 引言
生物超弱發光是生物在生命活動過程中，輻射出的一種極其微弱的光子流，分為自發發光和延遲發光。現在已經證明，它與生理代謝、光合作用和細胞分裂等等許多生命過程有關，并且對環境極為敏感。由于生物超弱發光蘊涵著豐富的生命信息，對其探測、分析與解讀是近十幾年來許多領域共同關心的課題。目前，已有不少研究，展示出其在揭示生命運轉機理以及農業、環境保護、醫療、食品衛生等許多領域的應用潛力。由于生物超弱發光的強度較弱，且延遲發光衰減很快，其采集涉及到外來激發光的精確控制和微弱自體發光的實時測量，至今未見成熟的專用儀器，給研究帶來困難。鑒于此，本文開發了一類利用LED激發的生物超弱發光采集系統，將LED激發光源、電子快門和光探測器整合在一起，通過單片機精確控制激發光源的光照時間與電子快門的開啟時間，使超弱發光尤其是延遲發光重復性測量的精度大大提高。
1 系統總體設計
該系統測量生物超弱發光的時域信息，采用單光子計數探測系統。主要包括激發光源、光源驅動電路、快門控制模塊、光探測器、數據采集與處理模塊、溫度控制模塊、暗室和計算機。系統總體結構如圖1所示。
樣品放在暗室中測量，隔絕外界光線影響。單只大功率超高亮度LED發出的光經過透鏡變換為平行光后，均勻照射到樣品上，中控模塊的單片機精確控制光強和輻照時間，溫度控制器保持樣品處于恒溫狀態，快門驅動模塊按照預設程序控制電子快門的開閉，PMT進行生物發光的采集。
2 系統硬件設計
2．1 主控制電路
主控電路負責整個系統的正常運行，進行光照時間、光照強度和快門開閉的控制，結構框圖如圖2所示。主要包括微處理器、壓控電流源、光照時間控制、快門開關控制、LCD顯示、鍵盤接口和溫度控制模塊。
2．2 激發光源及其驅動電路
生物體的自發發光強度較穩定，而延遲發光隨時間衰減很快，若將樣品用激發光源在暗室外照射后再拿進暗室測量，光照結束時間和測量開始時間的間隔很難控制，對實驗人員的技能要求較高。如果采用光源內置的方法，就能很好地解決這個問題。
系統采用單只大功率發光二極管(LED)作為激發光源，通過透鏡變換為平行光，保證樣品受光面的光強均勻分布。激發光源采用藍色LED，中心波長為467nm，帶寬為20nm，可以滿足一般實驗要求。也可以根據實驗的要求，將藍色LED更換為紅色、綠色和紫色等顏色的LED。
對LED光強的控制通過改變注入LED的電流大小來實現。為了保證實驗的精度，要保證LED驅動電流的恒流性，還要使得電路的電流大小可調，實現光源亮度的調節。因此，系統選用精密數控大功率電流源電路作為LED的驅動電路。電路的原理圖如圖3所示。
驅動電路主要由微處理器、液晶顯示與鍵盤輸入、數／模轉換與模／數轉換、壓控恒流源、差動放大電路等子模塊組成。
2．2．1 壓控恒流源
壓控恒流源是LED驅動電路的重要組成部分，它的功能是通過調節控制電壓來達到對電流的控制，它的性能決定了LED亮度的穩定程度。壓控恒流源的電路如圖4所示，U1B和R8，R9構成電壓跟隨器，運放的高輸入阻抗，近似可以認為U1B沒有分流作用，則流經V2的電流全部流入負載RL，并且有V3=V2。U1C和電阻R10，R11，R12構成反相器，有V4=-V3=-V2。U1A和電阻R1，R2，R3，R13構成反向加法器電路，輸入信號分別為Vi和V4，輸出電壓V1=-(Vi+V4)，又因為V4=-V2，所以輸出電壓V1=-(Vi-V2)。運放UB1并無分流作用，因此電阻Rm兩端的電壓為Vm=V1-V2=-Vi，流經Rm和負載RL的電流相等，都為I=Vm／Rm=-Vi／Rm。可以看出，負載上的電流由輸入電壓Vi和電阻Rm共同決定，只要這兩個量不變，電流就會保持恒定。通過改變數模轉換器的輸出電壓，即可調節負載RL上的電流。
負載RL是大功率的LED，所需要的驅動電流一般在0～300 mA，為了保證恒流電路的功率輸出，加入了電流擴展電路。該擴展電路采用簡單常用的圖騰柱式電流擴展方法。功率三極管使用大功率的2N1346，同時連接散熱片并加裝散熱風扇，以保證電路穩定工作。
2．2．2 差動放大電路
輸出電流經采樣電阻Rm采樣，接入差動放大電路的輸入端。在電流源電路中，采樣電阻的精確程度和溫度穩定性直接關系到電流輸出的穩定性。因此系統中采樣電阻使用精密金屬膜電阻，該電阻溫漂小于5x10-5℃-1，阻值為2 Ω，額定功率為10 W。
差動放大電路使用較常用的儀用放大器，電路原理如圖5所示。
儀用放大電路具有較高的輸入阻抗，能夠避免采樣電路對電流源的影響；同時又具有較大的共模抑制比，保證采樣的準確性，避免干擾。由于采樣電阻Rm上流經的電流變化范圍是0～300 mA，范圍較大，所以將差動放大電路的放大倍數設置為1。
2．2．3 數／模和模／數轉換
數／模轉換采用C8051F021單片機內部集成的DAC1，DAC的輸出在每次中斷時根據A／D的采樣值計算后進行更新。
模／數轉換采用單片機內部集成的12位逐次逼近寄存器型ADC。A／D和D／A的電壓基準VREF由片外的LM336基準穩壓源提供。
2．3 快門控制
為了防止LED光強對PMT造成損傷，在樣品室與PMT之間加裝了電子快門來保護PMT。開啟LED時，快門關閉；激發光源照射樣品結束時，LED熄滅，快門打開，PMT開始采集樣品的發光。由于延遲發光快速衰減，為了保證能夠及時采集延遲發光，該系統采用的電子快門的響應時間為1μs，快門驅動電壓為(12±O．1)V，電路接通則快門開啟，斷開則快門自動關閉，控制簡單。但電子快門對電壓穩定度要求較高，需要采用單獨的穩壓電源供電，否則有可能因電壓波動造成快門意外關閉。
電子快門驅動電路如圖6所示，開關管連接單片機P2．7口，由單片機控制快門的開啟和關閉。當單片機P2．7口輸出為“0”時，快門關閉；當單片機P2．7口輸出為“1”時，快門打開。用示波器測量驅動電路的延遲時間在1μs以內，考慮到快門的延遲也在1μs，可以認為快門總體的延遲對測量的影響可以忽略。
3 系統軟件設計
系統軟件部分采用模塊化設計方法，將整個程序劃分為若干模塊，通過主程序對各個子模塊的調用，將模塊連接成一個完整的程序。
根據系統控制功能的要求，確定了系統軟件的主要功能有：系統初始化，寄存器設定，鍵盤設定初始值(光照時間，快門開啟時間，流過LED的電流值大小)，液晶顯示控制，電子快門控制。根據軟件的功能要求，圖7給出程序總體流程結構圖，圖8表示各模塊之間的邏輯關系。
4 儀器測試
系統硬件連接完成，軟件調試通過后。接著對儀器進行了測試。
4．1 光源測試
使LED驅動電路的電流在O～300 mA范圍變化，測試LED的發光強度。測出驅動電流與光強的關系如圖9所示。
4．2 暗噪聲測試
圖10使用本系統測試的本底值，測量時的溫度為24℃，積分時間為0．5 s，PMT加載負高壓1 000 V。由圖10可見，暗室的背景噪聲在50 c／s(counts persecond)之下，計算得出本底噪聲的平均光子計數為27．48 c／s，結果較為理想。
4．3 樣品測試
完成系統的研制后，對金心吊蘭葉片的生物光子輻射延遲發光進行檢測。首先將樣品放入暗室中黑暗處理5 min，而后用藍色LED光源光照1 min，測量其延遲發光衰減曲線，測量時間50 s，間隔1 s，重復測量三次，探測結果如圖11所示。分別對三組測量數據之間的相關度進行擬合，結果表明，三組測量數據之阿的相關系數均接近O．999(見圖12(a)～(c))，結果表明該系統測量具有良好的可重復性，測量精度高。
5 結語
本文設計了用于測量生物超弱發光的專用測量系統，系統的激發光源由單顆高亮度大功率LED及光學系統構成，用壓恒流源調整LED光照強度，通過電子快門精確控制光探測器的采集時間，暗室的背景噪聲在50 c／s之下。應用本系統測量金心吊蘭葉片的延遲發光的結果表明，該系統測量精度高、重復性好，得到了較理想的測量結果。